PCDIII: Metodos diagnóstico

Diagnóstico

• Diagnóstico presuntivo -> Diagnóstico laboratorial -> Diagnóstico definitivo
• Porque é que se utilizam diferentes testes? Porque depende da patogénese do agente. Factores de virulencia podem ser mecanismo de identificação.

Amostras

• Selecção dos testes mais sensiveis para identificar o agente suspeito.
• Amostra na necropsia: tem em consideração a altura de colheita de amostras e condições climatéricas. Se aumentar a mortalidade, recolher amostras dos animais vivos. Não se usa sangue total porque coagulou, mas raramente pode-se utilizar soro (kits para zonas recondidas como um papel de filtro que é impregnado nos tecidos e lavado em laboratório para extrair as células onde se fazem testes sorológicos ou moleculares).
• Amostra in vivo: amostra de tecidos significativos para os sintomas e suspeita. Depende da fase em que encontramos o animal:
• Fase inicial com sintomasDetecção do agente, amostras com o agente.
  Ex. Virus - colheita de exsudados oculares/nasais, isolamento virico, imunofluorescencia, PCR (+ outro teste), ELISA (detecção de antigénio).
• Doença aguda mais avança sem sintomasDetectar anticorpos. Soros pareados para saber se soroconverteram. A 1ª amostra deve apresentar niveis baixos, a 2ª ter 4x o titulo da 1ª.
• Doenças agudas latentesA presença de anticorpos indica que o animal está infectado mas não podemos dizer que está doente por esse agente. Ex. IBR activa-se quando há diminuição das defesas do hospedeir
• Doenças crónicasPode-se utilizar testes sorológicos - animais portadores (leucose enzootica dos bovinos, anemia enzootica dos bovinos, brucelose, tuberculose). A prensença de anticorpos é relacionada com a infecção. Também na doença crónica latente, como no herpesvirus. Utilizar vacinas DIVAs. Utilizado em doenças de controlo e erradicação.

Testes

Soroneutralização

Condição necessária e obrigatória para considerar sorologia (pesquisa de anticorpos) diagnóstico definitivo: fazer soro pareado - duas colheitas do mesmo animal em tempos diferentes, uma na fase aguda e outra na fase convalescente.

Soroneutralização com soros pareadosPermite verificar a capacidade dos anticorpos que estão na amostra de neutralizar virus. Fazem-se diluindo a amostra de soro. Sistema indicador: células, ratinho (vida/morte).

• Nas placas juntamos células, um antigénio conhecido (ex. IBR) + anticorpos das amostras de campo (diluido). O cpe é a citopatologia em células provocada pelo agente (ex. IBR provoca lise). Num animal que produziu anticorpos, estes ligam ao IBR e impedem a lise (neutralizam o virus). 
• No soro 1 espero cpe porque o animal ainda não soroconverteu, não tem anticorpos. Apresentam todos o mesmo grau de cpe porque o virus tem sempre a mesma concentração.
• No soro 2 há anticorpos que neutralizam o virus e impedem a formação de cpe. Quando o soro tem baixa concentração, não há anticorpos suficientes e ocorrem alguns cpe. Neste caso o titulo é ¼ (ultima diluição que não forma placas). Concluo que o animal soroconverteu.

Inibição da Hemaglutinação
Mesmo principio, mas com sangue para agentes hemaglutinantes (com hemaglutininas): o corpo produz anticorpos que neutralizam, mas sem anticorpos há aglutinação.

  

ELISA

Ensaio imunoenzimatico que pode detectar antigénios ou anticorpos numa fase sólida (matriz, onde estão adsorvidos anticorpos especificos). No final da reacção, se existir afinidade para oa agente, vai haver formação de cor pelo substrato. Existe uma stop solution para parar a reacção.
Incuba-se, lava-se, adiciona-se conjugado (anticorpos especificos para o antigénio marcados por enzimas - ex. peroxidase, fosfatase alcalina), incuba-se, lava-se, substrato, formação de cor. Ler a bula do sistema e ver o principio do teste para se saber o que se está a testar (ex. o conjugado pode ser anti-anticorpos).

Sistemas de competição

Fase sólida com antigénios. Pressupoem usar anticorpos da amostra com anticorpos competitivos (quantitativo).

 

PCR

Teste de quantidades de ácidos nucleicos muito sensivel mesmo quando há poucos ácidos nucleicos na amostra (a quantidade do agente é ultrapassada). Amplifica porções genéticas do agente, focando-se especialmente em determinantes antigénicos de partes conservadas e pouco variáveis do virus (ex. na anemia hemorragica detecta-se o gene para a proteina VP60 que é uma região conservada, logo bom indicador).

• Fixação por complemento
• Rosa bengala

Fungos e Bacterias

• Isolar dos locais mais significativos, na mesma razão que existem em vivo.
• Transporte rápido, evitar secagem, presença ou não de O2, refrigerar.
• Observação a fresco.

• Esfregaço corado
  Gram
  Giemsa
  Ziehl-Nielsen
  Imunofluorescencia
  Campo escuro

• Tecnicas de cultura
  Meios enriquecidos. Pode ser confirmado por cel. inflamatorias em citologia.
  Agar sangue
  McConkey

• Meios imunologicos e moleculares
  PCR

• No isolamento viral utilizam-se para os intracelulares, culturas celulares e ovos embrionados. 
• Imunofluorescencia
  Imunoensaio com utilização de conjugado de isocianato de fluresceína (IF) que sob UV do microscópio emite luz cerd. Anticorpo marcado com fluresceína.

Virus

• Diagnóstico rápido para prevenção.
• Cultivo: culturas celulares, ovos embrionados, animais de laboratório.

• Isolamento Viral
  Efeito citopático nas células.
  Imunofluorescencia (IF): ac + fluorocromo (rodamina, FITC) + UV, em culturas celulares, bloquear reacções cruzadas.
  Microscopia electronica: tamanho e morfologia, rapido mas de baixa sensibilidade.
  Immune electron microscopy (IEM): concentração através do soro imune especifico.
  Imunohistoquimica

• Identificação
  Hibridização de ácidos nucleicos: sonda de DNA (radio-labelled) complementar a DNA viral. Blotting de DNA em matriz sólida (nitrocelulose).
  PCR: detecção de ácidos nucleicos por sintese cíclica de segmentos de DNA por primers. Transcrição reversa nos virus de RNA. Importante ferramenta de diagnóstico.
  ELISA: rápido e sensivel, detecção de antigénio ou anticorpo. Tem um anticorpo de captura ligado ao recipiente, o antigenio liga-se e um anticorpo de detecção liga-se por ultimo (tem enzima que confere cor).

• SorologiaSoroneutralização (SN): titula-se o soro (diluição seriada), junta-se quantidades iguais de virus a cada diluição de soro, juntar células de cultura (sistema indicador). Titulo é a ultima diluição que não forma placas (cpe).
  Inibição de hemaglutinação (HAI): Inactivar o complemento no soro, diluições seriadas do soro, juntar o vírus em 4-6 uni hemaglutinantes, incubar (ligação Ac-Ag), juntar suspensão de hemácias (sistema indicador), incubar. Titulo que inibe a hemaglutinação (com vírus as hemácias não sedimentam; anticorpos ligam-se ao vírus e permitem sedimentação de hemácias).
  Hemaglutinação: titulo é ultimo com hemaglutinação.
  Fixação do complemento: anticorpos presentes ligam ao complemento e não há lise dos eritrocitos pelo complemento.
  Imunodifusão: difusão de antigénios num meio semi-sólido (agar) formando uma linha de precipitação com soros especificos. Ag reage com Ac em particula - “cross linkage” para determinação de antigénios.
  ELISA
  Western Blot: separação electroforética de proteinas virais (em filtro de nitrocelulose), incubação em soro - bandas (Ac), muito especifico. 

• Quantificação viral
  Plaque assay: contagem de placas (plaquing forming uni/ml).
  TCID50: 50% tissue culture infectious dose
  LD50: