Citogenética

Erros na fase do ciclo celular

• Profase
• Endomitose: membrana celular não se dissolve.
• Metafase
• Restituição (c-metafase): não se formou fuso acromático, não há organização dos cromossomas (desorientados).
• Anafase
• Não-dijunção: dois cromossomas vão para o mesmo pólo. 
• Atraso na anafase: a separação dos cromossomas é rapida, mas alguns podem ser mais lento e perderem-se, não formando células filhas (erro não aceite).
• Telofase
• Formação de células binucleadas: se não ocorrer citocinese (divisão do citoplasma).

Profase I da meiose

• Leptoteno: inicio da compactação dos cromossomas e aproximação dos pares (estado de condensação, aparecimento dos primeiros cronomeros).
• Zigoteno: inicio do emparelhamento dos cromossomas (emparelhamento dos cromossomas homologos - sinapse), estado de emparelhamento.
• Paquíteno: emparelhamento de todos os pares de cromossomas (crossing-over, estado de recombinação).
• Diplóteno: inicio da separação dos cromossomas pelos pontos de quiasma (estado de sintese).
• Diacinese: terminalização dos pontos de quiasma (estado de recondensação).

Cromatina

DNA, RNA, proteinas histonicas (basicas) ou não histonicas (acidas), iões Ca e Mg.

Cromossoma

Fig. 1

• tp: telómero do braço curto
• p: braço curto
• c: centromero (constrição primária)
• q: braço longo
• tq: telómero do braço longo

Fig. 2

• b: contrição secundária onde se localiza o NOR (região dos organizadores nucleolares), pode ocupar posições diferentes conforme as especies.
• c: satélite citológico diferenciado (pedaço do cromossoma entre o NOR e o telómero).

Telómero: material genético nos extremos dos cromossomas, constituidos por multiplas sequências repetitivas (TTAGG) de 10 a 15 kilobases que são essenciais para a correcta estrutura e função dos cromossomas. Protegem os extremos e podem servir de relógio mitotico (DNA polimerase não os replica, apenas a telomerase o faz).

Classificação dos cromossomas (de acordo com a posição do centrómero)

• a: metacentrico
• b: submetacentrico
• c: acrocentrico
• d: telocentrico

Estrutura cromossomica

• Nucleossoma: um esquema central proteico de 4 proteinas (1º nivel).
• Solenoide: estrutura duplamente helicoidal resultante do enrolamento de bandas de nucleossomas dispostos em zig-zag.
• Modelo radial: os solenoides agrupam-se em alças.
• Modelo helicoidal: enrolamento progressivo da fibra (solenoide).
• Modelo misto.

Estudo da cromatina e regulação da expressão genética 

• Cromatina: complexo nucleoproteico que inclui o DNA estruturado em entidades separadas - os cromossomas.
• Eucromatina: descondensada, activa geneticamente, rica em genes, grau de condensação variavel, replicação precoce em S, DNA em sequencia única e moderadamente repetitivo.
• Heterocromatina: condensada, DNA altamente repetitivo (tipo DNA satélite), pobre em genes, praticamente inactiva, DNA de replicação tardia em S.
• Heterocromatina constitutiva: altamente repetitivaas (DNA satélite) e encontram-se em telomeros, regiões justacentroméricas, constrição secundaria ou outras (NOR) - localiza-se por bandas C, mesma posição em homologos.
• Heterocromatina facultativa: DNA de sequencia única e moderadamente repetitiva, genes especificos de tecidos (não housekeeping), cromossoma X em células femininas e em celúlas masculinas onda há mais do que um X - não tem sempre a mesma posição em homologos, não é localizado por C.

Inactivação do cromossoma X (mecanismo de compensação de dose): ao acaso (nas diferentes células do organismo), o X inactivado mantém-se constante para cada linha celular.

Epigenética

• Permite ou inibe a actividade genética.
• Cada tipo de células tem o seu epigenoma próprio.
• Mecanismos moleculares através dos quais o meio ambiente controla a expressão dos genes.
• Herança epigenética: herança de padrões de expressão de genes que não estão definidos nas suas sequencias de DNA.

Alterações bioquimicas associadas à regulação da expressão genética

• Metilação: o DNA para ser transcrito não deve estar metilado (citosina passa a 5-metilcitosina).
• Modificação de histonas: acetilação - activo, desacetilação - inactivo.
• Alteração da estrutura da cromatina:
• Gene activo: cromatina activa, citosina, acetilação.
• Gene inactivo: cromatina condensada, metilcitosina, desacetilação.

Alterações cromossomicas estruturais

Origem das quebras cromossómicas:

• Espontaneas: durante a replicação do DNA, independente do meio.
• Induzidas: por factores externos, ambientais.
• De origem genética: erros geneticos no sistema de reparação de DNA.

Intracromossomicas

• Deleção: desiquilibrada, a menos que seja de material genético inactivo.
• Inversão: equilibrada, se não houver efeito na posição. Paracentrica ou pericentrica.
• Desvio
• Intracromossoma: desiquilibrada, com duplicação/deleção de braços inteiros.
• Cromossoma emanel: dequilibrada, instabilidade cromossómica.

Intercromossomicas

• Translocação reciproca: equilibrada, se não houver efeito na posição.
• Translocação não reciproca
• Inserção
• Translocação em tandem: entre cromossomas homologos.
• Translocalçao robertsoniana: ex. entre cromossomas acrocentricos.

Consequencias na descendencia

• Inversão: alsa de inversão (gametas esquilibrado ou dequilibrado consoante a segregação meiotica).
• Translocação: cruz meiotica.

Tecnicas de marcação cromossómica

Coloração com Giemsa (rotina)

• Uniforme ao longo do cromossoma.
• Detecta variação no número e sexo.
• Visivel a constrição centromérica: identificar grupos de cromossomas pela morfologia, variações de forma e quebras.

Tecnicas de marcação por citogenetica convencional (bandeamento)

• Bandeamento diferencial:
• Bandas Q: fluorescencia da coloração com mostarda de quinocrina (UV), a fluorescencia desvanece rapidamente.
• Bandas G: pré-tratamento com solução salina a 60ºC ou enzimas proteolíticas (ex. tripsina), coloração com Giemsa, forma padrão de bandas escuras e claras.
• Bandas R: inverso das G, pré-tratamento alcalino a 90ºC seguido de coloração Giemsa.
• Bandas de alta resolução: tratamento in vivo com agentes bloqueadores do período S (metotrexano ou bromodeoxiuridina), libertado (com timidina), ciclo celular sincronizado.
  
• Bandeamento selectivo:
• Bandas C: tratamento ácido seguido de básico (hidroxido de bário) e Giemsa, marca heterocromatina constitutiva.
• Bandas NOR: precipitação de nitrato de prata.
• Bandas T: segmentos terminais (telomeros), derivante de R.
  
• Técnicas por citogenética molecular (hibridização in situ)
• FISH (fluorescent in situ hibridization)
• Sondas: sequencias de DNA ligadas a fluorocromos.
• Sondas de painting: marcam cromossomas especificos.
• Sondas centromericas: marcam regiões centroméricas de cromossomas especificos.
• Sondas de sequência única (genéticas): permitem identificar micro delecções e alterações.
• Sondas subteloméricas: permitem identificar translocações atipicas que envolvem regiões subtelomericas.
• Técnica de marcação por FISH
• Desnaturação e marcação da sonda com fluorocromo.
• Desnaturação do DNA dos cromossomas alvo do estudo.
• Hibridização da sondas com os cromossomas.
• Observação em microscopio de fluorescencia.
• IFISH (células em interfase)
• Visualização de alterações em núcleos inteiros.
• CGH (hibridização genómica comparatica)
• Detectar número de cópias de qualquer sequencia de DNA.
• Co-hibridização de sequências do individuo a testar (verde) com as do individuo normal (vermelho) em cromossomas metafasicos.
• Observação da intensidade das cores.
• SKY (FISH espectral)
• 24 sondas painting e 5 fluorocromos.
• Permite marcar de forma diferente cada um dos cromossomas.
• Estabelecimento do cariotipo por citologia convencional
• Observação de 15 a 20 metafases com bandeamento.
• Organização do cariótipo em 3 a 5 metafases.
• Detecção de mosaicismo
• Contagem de 15 metafases: despiste 20% moisaicismo.
• Contagem de 30 metafases: despiste 10% moisaicismo.
• Contagem de 60 metafases: despiste 5% moisaicismo.
• Estabelecimento do cariotipo por citologia molecular
• Observação 30 metafases, pesquisa de alteração em metafase.
• Observação 100 metafases, pesquisa de alteração em nucleos interfase.

Leitura e escrita de formulas cromossómicas

Cariotipo normal: 46, XX (nº total de cromossomas, heterocromossomas).

• 46 significa 23 pares (dissomia).

Alterações cromossómicas numericas

• Anomalia numerica em autossoma (+/- e autossoma)
  ex. 47, XX +21;  45, XX - 7.
• Anomalia numerica em heterossomas
  ex. 45, X;  48, XXYY.
• Várias anómalias: ordem crescente do nº de cromossom
  ex. 48, XX, +8, +21;  44, XX, -3, -7, +8, -9, +21, -22.

Nomenclatura no caso de mosaicismo

• Linha normal em último lugar, separada por /, [] nº de células observado.
  ex. 45, X [20];  46, XX [10]
• De maior nº de celulas observadas para menor.
  ex. 47, XXY [20] / 45, XX [10] / 48, XXY [4] / 46, XX [15]
• Linhas com alterações com nºs diferentes mas com o mesmo nº de células observado em ordem crescente do numero de cromossomas.
  ex. 47, XX, +8 [20] / 47, XX, +21 [20] / 46, XX [30]
• No caso de linhas com alterações nos heterossomas aparecem primeiro.
  ex. 45, X [20] / 47, XX, +8 [20] / 47, XX, +21 [20] / 46, XX [30]
• Alterações numericas e estruturais em igual nº de células primeiro põe-se as numericas.
  ex. 47, XXX [15] / 46, X, i(X)(q10) [15] / 46, XX [20]

Mosaicos - origem

• Não dijunção primário: zigoto com um cariotipo normal.
• Não dijunção secundário: alteração nos cromossomas dos gametas.

Nomenclatura no caso de quimerismo

• Do mesmo sexo: individuo normal (46, XX).
• Dois sexos, separa-se com // (46, XY // 46, XX)

Alterações cromossomicas estruturais

• Sistema curto (ex. 46, XY, del(6)(q23) )
• Inversão pericentrica: 1º braço curto.
• Inversão paracentrica: 1º lugar a mais proxima do centromero.
• 2 cromossomas envolvidos: 1º o de nº menor.
• Se a translocação envolver um cromossoma sexual este fica em 1º  (ex. 46, X, t(Xi7)(qteriq22) )
  
• Sistema detalhado



Numeração de bandas

• Segmentos de cromossomas →  (de... a...)
• Quebra :
• Quebra com reunião ::
• Braço curto p
• Braço longo q
• Anel r
• Translocação t
• Deleção del
• Duplicação dup
• Inserção ins
• Translocação reciproca rcp
• Robertsoniana rob
• Tandem tan
• Terminal do cromossoma ter
  
• Banda marcadora / landmark: caracteristica morfológica distinta, que é importante para a identificação do cromossoma.
• Banda: parte que se distingue por ser mais clara ou mais escura.
• Região: entre duas bandas marcadoras.
  
• Numeração de bandas: do centromero para o extremo.
• Indicar: simbolo do braço, nº da região, nº de banda (ex. q13; q25.3 - 3 é sub-banda).

Culturas celulares para análise cromossómica

Cultura de linfócitos

• Amostra: colheita de sangue periferico com seringa heparinizada (anticoagulante que não impede o crescimento celular).
• Meio de cultura: meio de suporte basal, nutrientes (soro fetal bovino), antibioticos (penicilina e estreptomicina), fitohemaglutinina (PHA) que induz o crescimento de linfócitos T.
• Incubação: 3 dias, 37º, 5% de CO2.

Fibroblastos

• Frascos próprios (aderem às superficies).
• Não se utiliza PHA.
• Leva mias tempo.
• Monitorização.
• Desagregação.

Células neoplasicas

• Não utiliza PHA.
• Tempo de incubação inferior (pode até ser só o do tratamento com colcemid).
  

• Bloqueio em metafase: adiciona-se colcemid (impede a formação do fuso acromático por dissolução da tubulina). T = 1h (se menos pode não bloquear metafases suficiente, se mais pode originar contracção exagerada de cromossomas).
• Tratamento com soluto hipotónico: após centrifugação, aplica-se KCl a 0,075M. Provoca a lise da membrana plasmática e entumescimento dos nucleos (espalhamento de cromossomas).
• Fixação: várias lavagens com ácido acético:metanol, a última aplica-se uma quantidade de fixador apropriada.
• Espalhamento cromossómico: lamina bem limpa, com pipeta de Pasteur deixar cair a gota de uma certa altura (essencial para obter cromossomas bem espalhados).
• Coloração base: Giemsa 4%.

Técnicas para estudo de instabilidade cromossómica

• Aberrações cromossómicas (AC): quebra do cromatideo, quebra nos 2 cromatideos, dicentrico, anel, tetraedal.
• Micronucleos (MN): cromossomas atrasam-se e são envolvidos por membrana.
• Sister chromatide exchanges (SCE): incorporação de BrdU em 2 ciclos de divisão consecutivos, com coloração dupla de Giemsa e Hoescht 33258, no 2º ciclo cada cromossoma terá um cromatideo monossubstituido (cora Giemsa) e bissubstituido (não cora com Giemsa).

Alterações cromossómicas numéricas

• Euploidia
• Haploidia (n)
• Diploidia (2n)
• Poliploidia (triploidia 3n, tetraploidia 4n)
  
• Origem:
• Erros de fertilização (triploidia)
• 1 ovo + 2 espermatozoides
• 1 ovo e globo polar não degenerado + 1 espermatozoide
• Alterações no ciclo de divisão
• Meiose: tetraploide e tripoloide.
• Mitose: aneuploide.
• Erro na interfase
• Endoreduplicação: poliploides.
• Erros na mitose
• Profase: endomitose, tetraploide.
• Metafase: restituição (c-metafase), tetraploide.
• Anafase: não dijunção ou atraso, aneuploide.
• Telofase: formação de celulas binucleadas, tetraploides.
• Erros na meiose
• Profase I (paquíteno): erros de recombinação.
• Anafase: não dijunção, atraso na ascenção.
• Formação de mitoses multipolares.
  
• Incidencia de não-dijunção maior em gâmetas femininos
• Cada ovulação forma apenas um gâmeta, não há selecção.
• Envelhecimento das células meióticas.
• Ausência de checkpoint na meiose.
  
• Não-dijunção na mitose
• Monossómicas e trissómicas.
  
• Mosaico
• Existencia de duas ou mais linhagens celulares com diferente nº de cromossomas.
• Fenótipo atenuado, depende do nº de celulas alteradas.
  
• Quimera
• Organismo constituido por 2 tipos de células genéticamente diferentes.
  
• Aneuploidia
• Hipodiploidia: nulissoma 2n-2, monossomia 2n-1.
• Dissomia: 2n.
• Hiperdiploidia: trissomia 2n+1, tetrassomia 2n+2.
  
• Poliploidia
• Incompativel com a vida (animal) excepto em alguns tecidos.
  
• Aneuploidias incompativeis com a vida
• Nulossomia
• Monossomia para autossomas
• Monossomia Y (sem X)
• Trissomia para grandes autossomas
• Polissomia dos autossomas de grau >3
  
• Aneuploidias compativeis com a vida
• Monossomia do X
• Polissomia de heterossomas >=3
• Trissomia de pequenos autossomas
  
• Exemplos de aneuploidias
• Sindrome de Turner (monossomia X): estatura baixa e esterilidade.
• Trissomia de heterossomas
• Trissomia X (mulher): fenotipo normal.
• Sindrome de Klinefelter (homem XXY): infertil, normal.
• Trissomia em pequenos autossomas
• Sindrome de Down (21).
• Sindrome de Patau (13).
• Sindrome de Edwards (18).
  
• Aneuploidias nos cromossomas sexuais: esterilidade, não há consequencia para a descendencia.
  
• Trissomia dos autossomas: se viáveis podem transmitir à descendencia (50% dos gametas).